應用案例（質量光度計-MP）：質量光度計表征蛋白質相互作用的平衡態

Characterization of protein interaction equilibria

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質量光度計定量了溶液中生物分子的質量分布。蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質複合物形成通常是涉及多個(ge) 成分的多步驟反應。質量光度計是一種新的分子光譜分析方法，它可以監測複雜的平衡反應的形成，並評估化學環境或蛋白質濃度的變化如何影響平衡。質量光度計以單分子方式直接測量樣品中所有蛋白質群體(ti) 的相對濃度。

從(cong) DNA複製到細胞周期控製，蛋白質-蛋白質相互作用對幾乎每一個(ge) 細胞過程都至關(guan) 重要。由於(yu) 蛋白質之間的相互作用主要是非共價(jia) 的，它們(men) 通常以平衡狀態存在。評估係統在擾動後如何恢複平衡，可以深入了解反應動力學，而相互作用親(qin) 和力是通過測量平衡時每個(ge) 組分的相對濃度來確定的。然而，當感興(xing) 趣的係統包括低濃度下的多個(ge) 反應或組分時，蛋白質-蛋白質相互作用的研究可能變得複雜。在這些條件下，體(ti) 積或平均測量值迅速下降。相比之下，質量光度計是一種單分子分析技術，因此它可以直接測量樣本中所有組分的分子質量和相對豐(feng) 度。在這裏，我們(men) 使用質量光度計研究形成四聚體(ti) 的重組蛋白的低聚過程。

表征反應平衡的形成

蛋白質-蛋白質相互作用係統受到幹擾後，如總蛋白質濃度的變化，係統會(hui) 重新平衡。此處研究的重組蛋白主要在高濃度（>100μM）下形成四聚體(ti) ，但我們(men) 研究了其在低nM濃度範圍內(nei) 的行為(wei) ，這在生理上更為(wei) 相關(guan) 。將樣品稀釋至10 nM後，通過光度測定法檢測到分子量與(yu) 單體(ti) 、二聚體(ti) 和四聚體(ti) 形式相對應的物種種群（圖1）。其他組分，如三聚體(ti) 、五聚體(ti) 和八聚體(ti) ，也可見，但豐(feng) 度較低。隨著時間的推移，四聚體(ti) 的比例減少，而單體(ti) 的比例增加，直到在大約一小時的培養(yang) 後達到質量平衡。二聚體(ti) 的比例隨時間大致保持不變。為(wei) 了生理相關(guan) 性，樣品在37°C下培養(yang) ；質量光度計測量在室溫下進行。在這裏，質量光度計提供了一種快速簡便的方法來評估所需的孵育時間，以確保隨後的實驗在平衡狀態下進行。

量化蛋白質濃度如何影響平衡狀態

一旦低聚體(ti) 係達到平衡狀態，每種蛋白質的相對濃度將隨著總蛋白質濃度的變化而變化。通常，總濃度的增加將有利於(yu) 形成高階蛋白質複合物，而減少將有利於(yu) 單體(ti) 或低階低聚物。質量光度計測定數據證實了研究中重組蛋白的這一預期：單體(ti) 在總蛋白濃度為(wei) 1-50 nM時Zui豐(feng) 富，四聚體(ti) 在100 nM時Zui豐(feng) 富（圖2）。盡管總蛋白濃度發生變化，但二聚體(ti) 比例大致保持不變。在上述示例中，質量光度計有效地測量了生理相關(guan) 蛋白質濃度範圍內(nei) 每個(ge) 低聚物物種的相對豐(feng) 度。這種測量非常有用，因為(wei) 低聚物狀態通常與(yu) 蛋白質活性直接相關(guan) 。因此，樣本中低聚物狀態的知識可以為(wei) 下遊應用的決(jue) 策提供信息。

評估環境因素如何影響平衡

環境的物理和化學性質——如溫度、離子強度或pH值——會(hui) 影響蛋白質相互作用的平衡。將平衡的重組蛋白樣品從(cong) 37°C移至較低溫度（室溫）會(hui) 擾亂(luan) 係統的平衡，導致四聚體(ti) 的相對比例隨時間增加（圖3A）。二聚體(ti) 的比例再次保持不變（數據未顯示）。

這些結果強調了在實驗過程中嚴(yan) 格控製溫度和孵育時間的重要性，並證明快速質量光度計測量對於(yu) 驗證所研究係統的狀態很有價(jia) 值。相反，當重組蛋白在水中而不是在PBS中培養(yang) 時，單體(ti) 和四聚體(ti) 數量的變化不太明顯。出乎意料的是，我們(men) 觀察到二聚體(ti) 數量顯著增加，盡管存在其他幹擾，但在PBS稀釋樣品中二聚體(ti) 數量先前保持不變（圖3B），這說明了通過質量光度計進行單分子方法量化每個(ge) 組分的重要性。

總的來說，對重組蛋白的三組測量表明，使用質量光度計在單個(ge) 分子水平上監測樣本中的所有蛋白質物種，可以對難以分析的多步驟反應提供有價(jia) 值的見解。

總結

涉及蛋白質相互作用和其他大分子相互作用的係統通常很複雜，使得體(ti) 積測量難以解釋。由於(yu) 其單分子性質，質量光度計通過提供樣品中所有組分的信息克服了這一挑戰（前提是感興(xing) 趣組分之間的分子質量存在足夠的差異）。質量光度計可在一定時間或條件下輕鬆監測溶液中樣品所有組分的相對濃度，無需任何蛋白質標記或固定。在這種方法的基礎上，最近發表的文章詳細描述了從(cong) 質量光度計數據計算平衡常數。