質量光度計測量蛋白質的變性

應用案例（質量光度計-MP）：質量光度計測量蛋白質的變性

Characterization of protein interaction equilibria

翻譯整理：棋牌95至尊

質量光度計量化了溶液中生物分子的質量分布。在自然條件下，已確定其用於(yu) 分析生物樣品的純度、完整性和功能。然而，其在變性條件下的性能尚未得到*評估。在本申請說明中，我們(men) 證明質量光度計是研究低聚物蛋白質變性（去折疊）和複性（再折疊）的有用工具。通過化學變性破壞蛋白質的天然結構可以深入了解蛋白質和複合物的結構和穩定性。尿素和鹽酸胍（GdnHCI）等化學變性劑通過改變蛋白質疏水殘基暴露於(yu) 周圍水溶液中，促進蛋白質的變性（去折疊）。雖然化學變性在生物化學研究中已經用了幾十年，但由於(yu) 其涉及大量分析技術，操作成本高，靈敏度低，數據分析和解釋太複雜，因此對變性（去折疊）和複性（再折疊）的監測仍然具有挑戰性。

在本應用說明中，我們(men) 探討了質量光度計（MP）的功能，以快速獲得有關(guan) 蛋白質去變性（去折疊）和複性（再折疊）的直觀結果。與(yu) 所有MP應用一樣，測量過程隻需極少量樣品，就可以方便地測試各種變性條件。為(wei) 了舉(ju) 例說明MP在非折疊/複性實驗中的優(you) 勢和局限性，我們(men) 對烯醇化酶進行了研究，這是一種已知可進行可逆變性的蛋白質。

質量光度計對結構不敏感

MP是一種超靈敏的單分子顯微鏡技術，用於(yu) 檢測玻璃-水界麵溶液中蛋白質（或其他生物分子）的散射信號。落在該界麵上的粒子散射的光量取決(jue) 於(yu) 粒子的質量，而不是其形狀。無論蛋白質是折疊的還是未折疊的，其質量都保持不變，MP讀數也保持不變。

我們(men) 在天然和變性條件下對烯醇化酶的MP測量表明MP對蛋白質折疊狀態不敏感。在自然條件下，烯醇化酶主要形成約93 kDa質量的二聚體(ti) 和一些約46 kDa質量的單體(ti) 。在變性條件下（尿素），二聚體(ti) 分離成大部分未折疊的單體(ti) 。然而，正如預期的那樣，未折疊單體(ti) 的質量（通過MP測量（〜46 kDa））與(yu) 折疊單體(ti) 的質量相同（圖1）。MP對折疊狀態的不敏感使其成為(wei) 監測折疊相關(guan) 寡聚的可行方法。

高濃度變性劑會(hui) 影響光學測量

蛋白質去折疊實驗通常在非常高濃度的變性劑下進行。然而，當尿素和GdnHCI在水溶液中濃度較高時，會(hui) 形成氫鍵聚集。這種團簇可以用MP觀察到，因為(wei) 聚集體(ti) 的光學性質不同於(yu) 周圍溶液的光學性質。這種差異導致背景光散射，在比率MP圖像中表現為(wei) 圖案（圖2）。隨著尿素濃度的增加，圖案及其相應的信號也增加，直到濃度超過1M尿素時達到平台（圖2）。

來自聚集體(ti) 的圖案信號表示背景噪聲，這將使使用MP測量生物分子的質量更加困難。MP測量的散射信號甚至可能不再是可量化的，尤其是對於(yu) 接近探測下限的較小物體(ti) 。因此，在使用變性劑時，檢查背景信號非常重要，這將為(wei) 實驗設置噪聲基線。以下章節描述了如何使用稀釋去除變性劑背景信號。

質量光度計揭示複性動力學

當變性劑背景被稀釋時，MP可以對變性過程提供有價(jia) 值的分析，從(cong) 而可以監測低聚蛋白質的複性動力學。烯醇化酶在自然條件下主要是二聚體(ti) ，在變性條件下24小時後幾乎*是單體(ti) 。當變性烯醇化酶樣品通過PBS稀釋回到接近自然條件時，MP質量分布圖捕捉到了這種變化（圖3）。稀釋後立即進行第一次測量，這得益於(yu) MP的快速性及其在寬質量範圍內(nei) 準確執行的能力。

我們(men) 還能夠使用MP監測變性烯醇化酶樣品的複性動力學，顯示二聚體(ti) 在稀釋後的最初60分鍾內(nei) 逐漸重新形成（圖3）。二聚體(ti) 回複動力學可以通過繪製單體(ti) /二聚體(ti) 比率隨時間的函數來可視化。回收率取決(jue) 於(yu) 所使用的變性物質，用GdnHCI變性的烯醇化酶恢複得更快（圖4）。回複過程提供了有關(guan) 蛋白質相互作用以及不同變性物質如何影響蛋白質相互作用的重要信息。

這項研究表明，即使在未折疊狀態下，MP也能提供有關(guan) 生物分子和複合物的質量和組成的寶貴信息。MP提供了一種簡單的方法來監測多聚體(ti) 複合物中蛋白質的變性和複性過程，並很容易比較變性劑的效果。