應用案例（超高速視頻級原子力顯微鏡-HS-AFM）：“眼見為實"HS-AFM實時成像粘連蛋白介導DNA環擠出的過程

翻譯整理：棋牌95至尊     

超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發，日本RIBM公司（生體(ti) 分子計測研究所株式會(hui) 社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(ye) 化的產(chan) 品，可以達到視頻級成像的商業(ye) 化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳(chuan) 統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限製，能夠在液體(ti) 環境下超快速動態成像，分辨率為(wei) 納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用於(yu) 生物大分子互作動態觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩(liang) 種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有150多位用戶，發表 SCI 文章 300 餘(yu) 篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級雜誌。

相較於(yu) 目前市場上的原子力顯微鏡成像設備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限製，掃描速度高可達 20 frame/s，並且有 4 種掃描台可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用於(yu) 生物大分子互作動態觀測。液體(ti) 環境下直接檢測，超快速動態成像，分辨率為(wei) 納米水平。探針小，適用於(yu) 生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧係數小，避免了對生物樣品等的損傷(shang) 。懸臂探針可自動漂移校準，適用於(yu) 長時間觀測。采用動態PID控製，高速掃描時仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。

HS-AFM不僅(jin) 擁有超高掃描速率與(yu) 原子級別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對單分子動態過程的捕捉變得十分方便，為(wei) 科研工作者研所和理解生物物理、生物化學、分子生物學、病毒學以及生物醫學等領域的單分子動態過程提供了一款強大的工具。

全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構，更低噪音、更高穩定性的2控製器，高速掃描器，緩衝(chong) 防震設計，主動阻尼，動態PID，驅動算法優(you) 化，多種前沿技術，可以實現在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新係統整合了基於(yu) 工作流程的操作軟件，直觀的用戶界麵與(yu) 流程化、自動化的設置使得研究人員可以專(zhuan) 注於(yu) 實驗設計，不需要複雜的操作和條件設置，快速獲取數據，加速研究的產(chan) 出。

Cohesin mediates DNA loop extrusion by a “swing and clamp" mechanism

CELL. VOLUME 184, ISSUE 21, P5448-5464.E22, OCTOBER 14, 2021

基因組DNA折疊形成環狀以及拓撲關(guan) 聯結構域（Topologically associating domains，TADs），從(cong) 而組成了基因組複雜的三維結構，這些三維結構具有重要的結構和調控作用。先前的研究已經逐漸揭示出基因組結構是由染色體(ti) 結構維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白複合物所介導的環擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層麵的研究表明SMC蛋白複合體(ti) 和Cohesin蛋白的確能夠將DNA擠壓形成環狀。因此，關(guan) 於(yu) 基因組的三維結構形成研究者們(men) 提出了“環擠出假說"，認為(wei) 染色體(ti) 結構維持的SMC複合物組織就基因組的拓撲結構，並通過環擠出來實現這一功能。但是這一過程的具體(ti) 細節是如何進行的還不得而知。

奧地利維也納生物中心 (VBC)分子病理學研究所Jan-Michael Peters研究組發現粘連蛋白通過“擺動和鉗夾"機製介導 DNA 環擠出。2021年10月7日出版的《細胞》雜誌發表了這一成果。

他們(men) 分析了人類粘連蛋白-NIPBL 複合物如何介導環擠出，並使間期細胞中的染色質折疊。 他們(men) 已經確定了環擠出所需的 DNA 結合位點和大規模構象變化，並確定了這些是如何協調的。他們(men) 的結果表明 DNA 通過自發的 50 nm 擺動的粘連蛋白鉸鏈轉移，將 DNA 交給 SMC3 的 ATPase 頭部，在那裏結合 ATP，然後DNA 被 NIPBL 夾住。

在這個(ge) 過程中，NIPBL 從(cong) 鉸鏈“跳躍"到 SMC3 頭部，從(cong) 而可能將自發鉸鏈擺動與(yu) ATP 依賴性 DNA 夾緊結合起來。 這些結果揭示了粘連蛋白-NIPBL 和可能的其他染色體(ti) 結構維持 (SMC)複合物如何介導環擠出的機械原理。

該實驗過程通過借助日本RIBM公司研發的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM來完成，HS-AFM突破了傳(chuan) 統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限製，能夠實現在液體(ti) 環境下超快速動態成像，分辨率為(wei) 納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用於(yu) 生物大分子互作動態觀測。

目前，一些體(ti) 外的生化重構實驗一定程度上已經證實了環擠出假說，這些結果證明SMC蛋白與(yu) Cohesin蛋白會(hui) 以2.1kb/s的速度擠壓DNA，並且這一過程依賴於(yu) ATP酶活性（圖2）。但限於(yu) 實驗分辨率等問題，環擠出的過程是如何實現的具體(ti) 細節還不得而知。

DNA環擠出過程中具體(ti) 的構象變化是如何發生的呢？為(wei) 了揭開這一過程的全貌，作者們(men) 應用了高速原子力顯微鏡（High-speed atomic force microscopy，HS-AFM）對Cohesin進行了實時成像。

DNA環擠出“擺-夾"“Swing and clamp"模型

在ATP存在的情況下的，Cohesin三聚體(ti) 複合物中會(hui) 在環狀、杆狀以及彎曲狀構象之間的變化。作者們(men) 發現DNA是通過Cohesin蛋白鉸鏈的彎曲進而易位的，這樣將DNA轉移到SMC3的ATP酶活性頭部，在該位置與(yu) ATP結合，DNA被NIPBL夾住。在此過程中NIPBL從(cong) 鉸鏈向SMC3頭部移動，引發鉸鏈區域的自發擺動以及ATP依賴的DNA結合，從(cong) 而形成一個(ge) 循環，使得DNA從(cong) 鉸鏈延伸到SMC3的頭部，在此循環周期的末尾，DNA片段可以轉移到SMC1的頭部。由此，作者們(men) 提出了DNA環擠出的“擺-夾"“Swing and clamp"模型，這類似於(yu) 抓娃娃機的小爪子，可以將通過鉸鏈的彎曲伸出機械手“抓住"DNA，然後上提，從(cong) 而通過一次次循環促使DNA逐步環擠出。

Cohesin mediates DNA loop extrusion by a “swing and clamp" mechanism

Abstract: Structural maintenance of chromosomes (SMC) complexes organize genome topology in all kingdoms of life and have been proposed to perform this function by DNA loop extrusion. How this process works is unknown. Here, we have analyzed how loop extrusion is mediated by human cohesin-NIPBL complexes, which enable chromatin folding in interphase cells. We have identified DNA binding sites and large-scale conformational changes that are required for loop extrusion and have determined how these are coordinated. Our results suggest that DNA is translocated by a spontaneous 50 nm-swing of cohesin’s hinge, which hands DNA over to the ATPase head of SMC3, where upon binding of ATP, DNA is clamped by NIPBL. During this process, NIPBL “jumps ship" from the hinge toward the SMC3 head and might thereby couple the spontaneous hinge swing to ATP-dependent DNA clamping. These results reveal mechanistic principles of how cohesin-NIPBL and possibly other SMC complexes mediate loop extrusion.

作者通過超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像，實現了對Cohesin促使的DNA環擠出過程的全紀錄，從(cong) 而能夠將DNA從(cong) 一個(ge) 結合位點帶到另一個(ge) 結合位點，揭開了SMC複合體(ti) 進行基因組的折疊的以及促進複雜基因組三維拓撲結構形成的機製。

這項工作的完成主要借助了日本RIBM公司研發的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM，HS-AFM突破了傳(chuan) 統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限製，能夠實現在液體(ti) 環境下超快速動態成像，分辨率為(wei) 納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用於(yu) 生物大分子互作動態觀測。推出至今，全球已有150多位用戶，發表SCI論文300餘(yu) 篇，其中包括Science, Nature, Cell 等頂級雜誌。 

小結：使用HS-AFM獲得的高空間&時間分辨率的視頻圖像，可以準確地反應生物大分子的運動狀態，用於(yu) 定量研究。

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