中檢院基於微流控芯片的肝-腎類器官串聯共培養進行藥物測試

中檢院基於(yu) 微流控芯片的肝-腎類器官串聯共培養(yang) 進行藥物測試

Repeated dose multi-drug testing using a microfluidic chip-based coculture of human liver and kidney proximal tubules equivalents

翻譯整理：棋牌95至尊

多器官微流控串聯芯片可模擬組織類器官培養(yang) 的微環境，實現類器官之間的串聯培養(yang) 並減少物種間的差異，所以該技術成為(wei) 一種前景廣闊的臨(lin) 床前藥物篩選的強大工具。中國食品藥品檢定研究院，安全評價(jia) 研究所（國家藥物安全評價(jia) 監測中心），首都醫科大學基礎醫學院、北京市藥品檢驗研究院、德國柏林工業(ye) 大學聯合德國TissUse GmbH公司的科學家一起合作，建立了一個(ge) 基於(yu) 微流控芯片的類器官模型，可以串聯肝髒和腎髒類器官，共同培養(yang) 16天。同時，對單獨給藥環孢素A（CsA））或聯合利福平給藥，進行了為(wei) 期14天的重複劑量的全身給藥。比較兩(liang) 種不同劑量的CsA對不同靶器官的毒性特征，與(yu) 連續14天使用csA治療相比，從(cong) 第6天開始聯合利福平用藥會(hui) 降低CsA濃度並減輕毒性。肝髒和腎髒類器官在類器官芯片上的串聯共培養(yang) ，顯示了其作為(wei) 藥物開發臨(lin) 床前階段重複劑量多種藥物毒性篩選的有效轉化工具的潛力。

藥物引起的腎毒性和肝毒性與(yu) 嚴(yan) 重的發病率和死亡率有關(guan) 。腎髒在維持電解質平衡以及處理過濾、分泌和重吸收方麵發揮著關(guan) 鍵作用。腎近曲小管通過主動運輸（重吸收或分泌）清除外源性物質，這得益於(yu) 表達功能性轉運蛋白的近端小管上皮細胞的強極化。肝髒控製著外源性物質的代謝，而腎髒則負責將其排出體(ti) 外。外源性物質的血漿濃度和生物利用度會(hui) 通過肝髒的毒性/解毒作用發生改變，從(cong) 而導致腎髒毒性的改變。因此。腎近曲小管和肝髒是毒性化合物的主要靶點。目前用於(yu) 證明藥物腎毒性和肝毒性的臨(lin) 床前模型包括體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 模型。然而，動物模型由於(yu) 培育時間長和動物倫(lun) 理問題存在局限性，在靜態條件下的傳(chuan) 統細胞培養(yang) 方法無法模擬類似體(ti) 內(nei) 的微環境。

為(wei) 了支持ToxCast/Tox21計劃，需要發掘更多的高通量毒性評估預測方法。人體(ti) 器官芯片技術的發展克服了當前臨(lin) 床前模型的缺陷，並支持3R原則（即替代、減少和優(you) 化動物使用）。目前的類器官串聯芯片集成了微流泵和類器官培養(yang) 部分，使得液體(ti) 與(yu) 組織的比例與(yu) 人體(ti) 中的相似。肝-腎串聯芯片滿足體(ti) 係中營養(yang) 物、化合物及類器官代謝物的分布和交換，因此兩(liang) 種類器官之間的交流通訊得以保證。

圖1、微流控肝腎二器官串聯芯片。（A）裝置的放大圖，包括容納兩(liang) 個(ge) 微流道的PDMS芯片。（B）紅色粗體(ti) 箭頭表示微流道內(nei) 的液體(ti) 流動方向，以及在MOC中共同培養(yang) 肝髒、腎髒類器官的實驗設置。（C）16天共培養(yang) 的示意圖，包括2天的適應期和14天的重複給藥，每天交換培養(yang) 基，第1、7和14天收集上清，第0和14天收集細胞樣本。

平衡穩態確保可以觀察到肝髒和/或腎髒損傷(shang) 的不同階段。此外，人類腎近端小管細胞可以形成一個(ge) 完整的屏障，並表達對藥物誘導的腎損傷(shang) 和藥物相互作用至關(guan) 重要的功能性酶和轉運蛋白。共培養(yang) 的肝髒類器官表達了肝特異性標記、人類酶和轉運蛋白，其水平與(yu) 2D細胞培養(yang) 相當甚至更高，並至少維持了28天。

環孢素A（CsA）是一種具有腎、肝毒性作用的免疫抑製劑，被用作模型藥物來刺激基於(yu) 芯片的肝腎共培養(yang) 係統。為(wei) 了進一步評估二聯器官芯片（2-OC）上的藥物代謝和毒性，我們(men) 使用了CsA和利福平（RFP，一種肝酶和轉運體(ti) 誘導劑）的聯合給藥。關(guan) 於(yu) CsA的藥理學、藥代動力學和毒性的研究結果表明，不同物種之間存在很大差異，尤其是在代謝特征方麵。因此，根據臨(lin) 床試驗中使用的劑量，將兩(liang) 種不同的CsA劑量（無毒/有毒劑量）和RFP治療劑量應用於(yu) 二連器官串聯芯片。

據我們(men) 所知，這是SHOUCI有研究表明基於(yu) 微流控芯片的肝-腎類器官串聯共培養(yang) 模型可用於(yu) 連續14天重複單獨或聯合給藥的毒性研究。肝-腎類器官芯片可有效模擬藥物在人體(ti) 內(nei) 的相互作用過程及其對毒性的影響。研究結果表明，肝-腎類器官串聯共培養(yang) 芯片有望結合形態學、組織病理學、分子生物學、藥物代謝和無創毒性生物標誌物的檢測，闡明藥物相互作用、代謝和毒性。

結果

我們(men) 設計了一個(ge) 可容納兩(liang) 個(ge) 相同微流路的二聯器官芯片，每個(ge) 回路將腎近端小管屏障與(yu) 髒類器官串聯，用於(yu) 後續的共培養(yang) 。（圖1 A / B ）。

腎近曲小管屏障的特征、完整性和功能：RPTEC/TERT1細胞在transwell上貼壁培養(yang) ，分化並形成了完整的單細胞層（圖2A）。免疫熒光染色結果表明RPTEC/TERT1細胞清晰地顯示了泛上皮標記物CK8/18（圖2B，C）。通過對乙酰化微管蛋白的染色觀察到了初級纖毛的形成（圖2D）。圖2E和圖2F分別顯示了MRP-2和Na+-K+-ATPase的定位，這些是功能性極化單層RPTEC的指標。ZO-1（圖2G）和Claudin-10（圖2H）在細胞邊界的表達證實了鄰近RPTEC/TERT1細胞之間形成了緊密連接，並表明了適當的細胞極化以及屏障的完整性。Ki67的陽性染色（圖2I）顯示了增殖的細胞。

在圖2J-L中展示了在2-OCs中16天培養(yang) 期間，功能性轉運蛋白MRP-2、P-gp和Ki67的RT-qPCR分析結果，用作基因表達變化的對照。

圖2、腎近端小管屏障的特征。 （A） Transwell上形成腎近端小管單層細胞。 （B） CK8/18（綠色） （C） CK8/18（綠色），橫截麵 （D） 乙酰化微管蛋白（綠色） （E） MRP-2（紅色） （F） 鈉鉀ATP酶（紅色） （G） ZO-1（紅色） （H） Claudin-10（紅色） （I） Ki67（紅色）。 細胞核用DAPI（藍色）染色。 比例尺：B、D和E：100μm；C、F、G、H和I：50μm。 對（J） MRP-2 （K） P-gp （L） Ki67的基因表達進行qRT-PCR分析。數據為(wei) 平均值 ± 標準誤差，實驗進行了三次重複。

肝的特征和功能：HepaRG細胞的形態和分化、肝球的形成、免疫熒光染色以及肝髒功能酶和轉運體(ti) 的RT-PCR分析見附錄。圖1.結果表明，微流控多器官串聯芯片中的肝球體(ti) 具有長期維持和可重複分化的特點，細胞增殖、分化和凋亡之間達到了平衡，從(cong) 而實現了肝球體(ti) 的生理平衡。

二器官串聯芯片培養(yang) 16天的表現：腎髒類器官（代表排泄係統）和微流道通路（代替血液循環）中的LDH水平的檢測結果表明（圖3A）二器官芯片中的排泄係統和血液循環中的LDH產(chan) 生水平保持穩定，這表明在整個(ge) 16天的共培養(yang) 過程中，不同培養(yang) 腔內(nei) 的細胞發生了人為(wei) 但穩定的生理更替。

在16天的共培養(yang) 期間，兩(liang) 種培養(yang) 基中的葡萄糖水平測量結果總結在圖3B中。微流道通路和培養(yang) 腔的葡萄糖濃度嚴(yan) 格維持在2.5 mM至6mM之間，以確保為(wei) 二聯器官芯片提供足夠的能量。近端小管腔內(nei) 的葡萄糖水平比初始培養(yang) 基中的17.5 mM降低了大約三倍。微流道循環中的葡萄糖濃度持續下降到初始11.1 mM的50%，這在正常血糖的範圍內(nei) 。這些發現表明，在16天的肝-腎串聯共培養(yang) 期間，二聯器官芯片建立了一個(ge) 非常穩定的葡萄糖平衡。

圖3、16天內(nei) 肝腎類器官共培養(yang) 係統的表現。（A）2-OC係統中的係統組織活力由微流道通路（紅色）和近端小管腔（黃色）乳酸脫氫酶（LDH）產(chan) 量表示。（B）2-OC中的流道通路（紅色）和近端小管腔內(nei) （黃色）的葡萄糖濃度平衡。虛線代表每天加入肝髒部位（紅色）和近端小管腔內(nei) （黃色）的培養(yang) 基的初始葡萄糖濃度。（C）通過測量循環培養(yang) 基中的乳酸產(chan) 量和葡萄糖消耗來衡量共培養(yang) 的代謝活性。

我們(men) 利用微流道通路中的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，作為(wei) 評價(jia) 共培養(yang) 係統代謝活動的指標（圖3C）。2-OC係統的新陳代謝活動呈現雙相曲線，在前兩(liang) 天未給藥的情況下，新陳代謝活動持續下降，而從(cong) 第零天開始，新陳代謝活動進入穩定狀態，略有波動。微流道通路中乳酸生成量的輕微下降可能表明肝球和近端小管屏障之間存在條件效應。

細胞活力和代謝曲線都證明，2-OC係統可以同時、連續培養(yang) 肝、腎類器官16天，同時保持其活力和特征功能。以重複性高，穩定性強的方式建立微流控連接的串聯共培養(yang) 係統有利於(yu) 在後續實驗中應用這些物質。

基於(yu) 芯片的肝-腎棋牌平台资讯十四天重複劑量藥物暴露模型：用CsA或CsA結合RFP處理基於(yu) 芯片的肝-腎串聯共培養(yang) 模型，以觀察在不同程度的毒性威脅下器官之間的相互作用。在給藥第一天（第1天）和最後一天（第14天）以及聯合給藥第一天（第7天）之後的24小時，取樣檢測肝類器官代謝後的CsA（圖4A）或RFP（圖4B）濃度。如圖4C所示，在第1天、第7天和第14天給藥後24小時，隨著劑量水平從(cong) 5uM增加到20 uM肝類器官在微流道通路的CsA暴露增加。連續給藥七天後24小時的CsA水平低於(yu) 第一次和最後一次給藥後的水平。在第一次和最後一次聯合給藥後，當20 uMCsA與(yu) 25uM RFP全身聯合給藥時，微流道通路中的CsA濃度下降。同時給藥RFP8天後，有RFP或無RFP循環之間CsA濃度的降低有所減弱。同時，每天聯合給藥8天後，RFP的濃度增加（圖4D），表明RFP在微流道通路積累。為(wei) 了評估毒性物質對肝、腎類器官的影響，我們(men) 檢查了乳酸脫氫酶（LDH）的釋放。LDH作為(wei) 評估體(ti) 外腎毒性的可靠生物標誌物，我們(men) 在兩(liang) 種培養(yang) 基中進行了測定。在第1天、第7天和第14天，隨著環孢素A（CsA）濃度的增加，微流道通路中的LDH濃度逐漸增加（圖 5A）。連續8天聯合給藥25uM RFP後，全身給藥20uM CsA的血路中LDH水平下降，這與(yu) 微流道通路中的CsA濃度一致。然而，SHOU CI 聯合給藥後未觀察到這種下降（圖5A）。在實驗終點，聯合給藥組的p53基因表達比未處理的對照組增加了1.5倍，而Ki67的表達沒有變化（圖5B，C）。然而，排泄腔中的LDH釋放量顯示出急劇但不顯著的增加（圖5H）。SHOU CI 聯合給藥後，與(yu) 未處理的對照組相比，第7天的IDH水平繼續升高（圖5H）。然而，在同時使用RFP8天後，可以觀察到LDH水平急劇下降（圖5H）。此外，與(yu) 對照細胞相比，用高劑量CsA處理14天的腎類器官中p53基因的表達量增加了2.3倍（圖5I，J）。同時用CsA和RFP處理的腎類器官中，Ki67基因的表達量增加了2.7倍，而在實驗終點，低劑量組和高劑量組的Ki67表達量都顯著下降（圖5I，J）。如圖5D-G所示，TUNEL/Ki67/DAPT三重染色顯示CsA暴露增加了細胞死亡，而在CsA與(yu) RFP聯用的肝海綿體(ti) 中可以觀察到細胞死亡的緩解。通過 Ki67陽性染色觀察到的增殖細胞均勻地分布在肝球中，並保持在芯片中，不同處理組之間沒有顯著變化（圖5D-G）。

常規和新型非侵入性毒性生物標誌物的蛋白質表達：為(wei) 了探索MOC平台在早期檢測和診斷器官特異性毒性方麵的進一步應用，我們(men) 檢測了已被批準用於(yu) 臨(lin) 床實踐的常規和新型生物標誌物，以確定本實驗中的藥物誘導的肝髒和腎髒損傷(shang) 。生物標誌物水平變化的觀察結果列於(yu) 補充表3中。

圖4、每日給藥或聯合給藥後CsA和RFP的濃度測定以及2-OC中肝-腎類器官的代謝。（A）循環介質中CsA的質譜。箭頭表示CsA的特征峰。（B）循環培養(yang) 基中RFP的質譜。箭頭表示RFP的特征峰。（C）每天重複給藥，聯合給藥後循環介質中CsA的濃度，以及第1、7和14天在2-OC中肝-腎類器官的代謝情況。（D）每天重複聯合給藥後循環介質中RFP的濃度，以及第7和14天在2-OC中肝-腎類器官的代謝情況。實驗分別在對照組和低劑量組進行了三次重複，而在高劑量組和聯合給藥組進行了四次重複。* （#） 或 **（##） 分別表示 p 值小於(yu) 0.05 或0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與(yu) 相應對照組或聯合給藥組與(yu) 高劑量組比較的差異。

微流道通路中的生物標誌物（圖6），肝酶AST呈劑量依賴性升高，聯合用藥組的AST水平在終點而非RFPSHOU CI 用藥後出現下降。ALP在CsA治療後升高，僅(jin) 在第14天有顯著變化，而在20uM CsA給藥時，同時使用RFP會(hui) 降低ALP水平。隻有在RFP後階段才能觀察到TBiI的顯著增加。微流道通路中葡萄糖的下降呈劑量依賴性，這些分子在第7天的高劑量組和第14天的兩(liang) 個(ge) 治療組中都達到了有統計學意義(yi) 的水平。同時使用20 uM CsA和RFP治療後，在聯合給藥階段，代用血回路中的葡萄糖濃度升高。代用血中的腎毒性生物標誌物CRE和UREA在第1天有所增加，但在第7天和第14天未觀察到與(yu) 藥物有關(guan) 的變化。AB、GGT和Lac的水平未發現與(yu) CsA相關(guan) 的變化。

在排泄係統中的生物標誌物：在排泄介質中（見圖7），GGT（γ-穀氨酰轉移酶）水平在第一天顯示出劑量依賴性增加。然而，在連續七次CsA治療後，高劑量組的GGT水平明顯下降，第14天也觀察到了類似的效果。與(yu) RFP的同時治療在第7天和第14天並未導致GGT水平降低。所有治療組的近端小管屏障部分也是如此。

圖5、在肝-腎類器官串聯芯片中每日單獨或同時使用CsA14天的毒性概況。（A）第1、7和14天代用血液培養(yang) 基中的LDH活性。qRT-PCR分析實驗終點時肝髒球體(ti) 內(nei) （B）p53（C）Ki6基因的表達。實驗結束時，（D）對照組、（E）低劑量組、（F）高劑量組和（G）聯合用藥組肝球形細胞的TUNEL/Ki67（綠色/紅色）染色。（H）第1、7和14天排泄介質中的LDH活性。實驗終點時，近端小管屏障中（I） p53和（J）Ki67基因表達的qRT-PCR分析。數據為(wei) 平均值主±標準差，實驗分別在對照組和低劑量組進行了三次重複，而在高劑量組和聯合給藥組進行了四次重複。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小於(yu) 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與(yu) 相應對照組或聯合給藥組與(yu) 高劑量組比較的差異。 

隨著CsA劑量的增加，尿液中的NAG酶也會(hui) 分泌。CsA和RFP對排泄池中ALP的影響相似。在CsA作用下，葡萄糖呈劑量依賴性下降，聯合用藥組的葡萄糖水平低於(yu) CsA治療組。CsA治療後Lac濃度明顯升高，而RFP減輕了CsA對Lac分泌的影響。

圖6、在肝-腎串聯培養(yang) 芯片中每天單獨或同時使用CsA 14天後，微流道通路中無創毒性生物標誌物的蛋白質表達。蛋白水平（A）AST（B）ALP（C） TBiL（D）Glucose（E） CRE（F）UREA（G）AIB（H）CGT（I）第1、7和14天循環介質中的乳酸鹽。數據為(wei) 平均值主±標準差，實驗分別在對照組和低劑量組進行了三次重複，而在高劑量組和聯合給藥組進行了四次重複。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小於(yu) 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與(yu) 相應對照組或聯合給藥組與(yu) 高劑量組比較的差異。
    KIM-1是腎髒特異性生物標誌物，已通過監管機構的正式鑒定，在整個(ge) 研究期間呈劑量依賴性升高，CsA介導的KM-1升高隨時間推移而減弱，同時服用RFP時也是如此。排泄介質中的CysC和ColIⅣ水平也出現了類似的結果。但在RFP後階段，RFP會(hui) 增強ColIⅣ的作用。CsA治療後，Clu和NGAL的濃度明顯升高，而RFP明顯降低了Clu和NGAL的水平。此外，在研究的中期階段，這兩(liang) 種生物標誌物的分泌水平達到了ZUI 高水平，使用RFP後的降低幅度也最大。在實驗期間，OA的分泌水平是持續的，高劑量組的OA水平維持在較高水平。聯合給藥組的OA降低呈延遲顯著性。同樣，用20uM CsA處理後，IP-10有所增加，而RFP則在第14天使IP-10略有下降。CsA誘導的GST-a和白蛋白水平的劑量依賴性增加僅(jin) 在第1天才能觀察到。CsA增強了FABP-1，而同時使用RFP產(chan) 生的降低直到後期（第14天）才被觀察到，而REN和a1-MG在第7天和第14天發生了類似的藥物誘導變化。在第1天，CsA可引起OPN的增加，但與(yu) 劑量無關(guan) ，而在第7天，OPN的增加與(yu) 劑量有關(guan) 。雖然CsA對OPN的影響在第14天消失了，但RFP誘導的OPN明顯降低在RFP後階段得以保持。TIMP-1在第1天顯示出劑量依賴性的顯著增加。然而，CsA對TIMP-1的影響在第7天和第14天逆轉。在RFP後階段，CsA對TIMP-1水平的增加有不同程度的減弱。使用CsA或同時使用RFP治療後，EGF會(hui) 出現劑量依賴性下降。在CAIB和TFF-3中未觀察到與(yu) 藥物相關(guan) 的變化（數據未顯示）。

圖7、在肝-腎串聯培養(yang) 芯片中每天單獨或同時使用CsA 14天後，排泄腔中非侵入性毒性生物標誌物的蛋白質表達。（A）CGT （B） ALP（C）NAG（D）葡萄糖（E）乳酸鹽（F）KIM-1（G）胱抑素C的蛋白質水平（H）膠原Ⅳ（I）凝集素（J）NGAL （K）骨活素（L）IP-10（M）GST-a（N）白蛋白（O）FABP-1（P）腎素（Q）α1-微球蛋白（R）骨素（S）TIMP-1（T）第1天、第7天和第8天排泄培養(yang) 基中的表皮生長因子14。數據為(wei) 平均值±SEM，實驗分別在對照組和低劑量組進行了三次重複，而在高劑量組和聯合給藥組進行了四次重複。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小於(yu) 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與(yu) 相應對照組或聯合給藥組與(yu) 高劑量組比較的差異。

代謝酶和轉運體(ti) 基因表達的變化：在本研究中，我們(men) 進一步研究了在兩(liang) 個(ge) 類器官中表達的功能酶和轉運體(ti) 及其在解毒或毒化過程中的作用（圖8）。實驗結束時，同時使用RFP會(hui) 顯著誘導肝髒、腎髒類器官中MRP-2的表達。與(yu) RFP同時給藥後，肝球體(ti) 中Pgp基因的表達略有增加。相比之下，RPTEC/TERT1細胞中的P-gp基因表達可以通過連續使用環孢素A （CsA） 顯著誘導，而在聯合給藥組中，P-gp基因的誘導則無法觀察到。

圖8、在肝-腎串聯共培養(yang) 芯片中每天單獨或同時使用RFP 14天後，代謝酶和轉運體(ti) 在肝球和近端小管屏障中的基因表達。實驗結束時，肝髒（A）MRP-2（C） Pgp （E）CYP3A4 （F）BSEP和腎內(nei) （B）MRP-2（D）P-gp的mRNA表達量與(yu) 對照組相比的折疊變化。數據為(wei) 平均值± 標準差，實驗分別在對照組和低劑量組進行了三次重複，而在高劑量組和聯合給藥組進行了四次重複。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小於(yu) 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與(yu) 相應對照組或聯合給藥組與(yu) 高劑量組比較的差異。

在CsA處理組中，觀察到CYP3A4和BSEP的表達有統計學意義(yi) 和劑量依賴性的下降。CsA對BSEP的抑製作用因同時給予RHP而略有減弱，而CsA組和同時治療組之間的CYP3A4則無明顯差異。

討論

最新研究表明，類器官芯片技術可重建三維（3D）微環境，模擬人體(ti) 器官和組織的結構、力學、生理和代謝特性。例如，利用三維技術建立的肝類器官模型顯示出增強的肝功能，特別是當非實質細胞被整合進類器官時。我們(men) 已經開發出了聚集穩定且重複的肝類器官分化方案，其中包括分化的HepaRG（實質）和HHSteC（非實質）細胞，並能夠再現肝小葉結構，即肝髒的功能單位。HepaRG細胞係被用作體(ti) 外模型來預測藥物對人體(ti) 細胞色素P450 （P450）酶的誘導作用。此外，模擬圍繞肝類器官的流體(ti) 剪切應力和間質壓力有助於(yu) 在芯片中長時間維持基於(yu) 蛋白質和氧梯度的穩定微環境。而且，包括ZO-1和Claudin-10在內(nei) 的相關(guan) 蛋白的表達，表明在整個(ge) 共培養(yang) 過程中，近曲小管細胞屏障的緊密連接組裝和細胞極性得到了保持。

長期以來，血清中的肌酐（CRE）和尿素（UREA）的測量已被用於(yu) 診斷CsA引起的腎毒性；然而，如本研究所觀察到的，這些生物標誌物在長時間內(nei) 不顯示分泌，因此不敏感且不足。人類RPTEC/TERT1細胞係被證明能夠極化形成緊密的單層，並表達特定組織的酶和轉運蛋白較長時間，因此已被建立為(wei) 藥物安全評估的體(ti) 外模型。現有的基於(yu) 芯片的肝髒-近曲小管共培養(yang) 模型複製了兩(liang) 個(ge) 器官和室間的長期生理和分子通信。芯片中共培養(yang) 的近曲小管屏障等價(jia) 物表達了若幹生物標誌物，如KIM-1、CLU、OA和NGAL，用於(yu) 長時間的毒性評估，模擬體(ti) 內(nei) 對腎毒性暴露的反應。FDA和EMEA已批準了八種非侵入性腎損傷(shang) 生物標誌物，這些標誌物在體(ti) 內(nei) 已被充分描述，並且能在動物或人類的尿液或血液中檢測到。在這八種合格的生物標誌物中，KIM-1、白蛋白、Clu和TFF-3被認為(wei) 是與(yu) 急性腎小管變性相關(guan) 的標誌物。

與(yu) 先前研究一致，對急性CsA誘導的腎毒性有反應的其餘(yu) 標記物，包括排泄介質中的GST-α、NGAL、OPN、GGT、NAG和TIMP-1，以及代用血中的CRE和UREA，可以被分類為(wei) 腎小管功能損傷(shang) 的生物標誌物。研究顯示，與(yu) 急性腎小管上皮損傷(shang) （包括CsA引起的損傷(shang) 和體(ti) 內(nei) 小管間質纖維化）相關(guan) 的OA上調。OA的劑量依賴性增加支持了將OA分類為(wei) 早期近曲小管損傷(shang) 的敏感生物標誌物的結論。主要在肝髒產(chan) 生的尿液α1-MG在小管和腎小球損傷(shang) 時都可能升高。肝特異性的FABP（即FABP-1）在近曲小管中表達。這些分子都是急性和尤其是慢性腎小管損傷(shang) 的生物標誌物，因此，這些發現可以部分解釋治療晚期才觀察到的FABP-1和α1-MG水平升高。整個(ge) 研究期間，高劑量CsA上調了Col IV。此外，Col IV在腎小管基底膜中表達；因此，共給藥組中Col IV的上調表明了在第14天Ki67基因表達誘導下的腎上皮細胞再生。CALB存在於(yu) 小腸中，在長期使用CsA後會(hui) 在遠端腎小管中受到抑製。因此，CALB作為(wei) 體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 腎小管損傷(shang) 的生物標誌物對CsA的單次和重複治療的反應與(yu) 藥物無關(guan) 。這是SHOU CI 報告在微流控MOC平台上評估一係列合格和潛在的非侵入性腎毒性生物標誌物，展示了MOC在早期藥物開發中進行高通量篩選的能力和優(you) 勢。
        腸道屏障和腎小球等價(jia) 物將被整合到新型的MOC係統中，例如四器官芯片，以改進和優(you) 化我們(men) 的研究。一方麵，需要考慮CsA的低生物利用度。CsA的低生物利用度主要是由於(yu) 肝髒代謝，部分原因是腸道吸收。生物利用度的降低很可能可以通過腸道CYP450酶的誘導來解釋，這種誘導顯著大於(yu) 肝髒代謝的誘導。CsA對體(ti) 內(nei) 腸肝循環的影響將在MOC平台上得以模擬。
結論
        本研究評估的微流控多器官芯片平台使得可以在16天內(nei) ，通過連接的培養(yang) 基回路，非接觸共培養(yang) 可重複且定義(yi) 明確的肝球體(ti) 和腎近曲小管屏障，每種結構比其人體(ti) 對應器官小100,000倍。此外，微流控設備和2-OC模型中設計的流體(ti) 與(yu) 組織比率支持充分的器官間通訊。最後，共培養(yang) 的組織等價(jia) 物表達了組織特異性的標誌物、酶和轉運蛋白，並且可以通過具有肝毒性和腎毒性的CsA進行挑戰，這些毒性可以通過肝髒藥物代謝誘導劑RFP得到緩解。目前基於(yu) 微流控芯片的平台適合標準化的微組織大小和組織培養(yang) 格式，可廣泛應用於(yu) 藥物篩選，並且越來越多地被監管機構接受。

材料和方法

設計和製造二聯器官芯片：商業(ye) 可用的微生理二聯器官芯片2-OC由兩(liang) 個(ge) 96孔細胞培養(yang) 插件集成。2-OC的製造由TissUse GmbH按照Wagner等人的描述進行。電路中的流體(ti) 流動是由根據Wu等人的修改，在芯片上的脈衝(chong) 式微型泵建立的。芯片上的微型泵通過由TissUse GmbH提供的外部控製單元的壓縮空氣來驅動。

人類細胞來源：人類HepaRG細胞係和人類近曲小管細胞係RPTEC/TERT1（CRL-4031）均從(cong) ATCC（位於(yu) 美國弗吉尼亞(ya) 州曼納薩斯的ATCC）購買(mai) 。HHSteC細胞係是從(cong) ScienCell研究實驗室（位於(yu) 美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德的ScienCell）購買(mai) 的。

肝髒類器官培養(yang) ：HepaRG細胞在HepaRG培養(yang) 基中培養(yang) （含William’s medium E，補充10%胎牛血清（FBS, Life Technologies; 澳大利亞(ya) 新南威爾士州悉尼），2 mM GlutaMAX，10000 U/ml青黴素，10000 μg/ml鏈黴素，5 µg/ml人胰島素（Sigma-Aldrich, 美國聖路易斯）和5×10–5 M氫化可的鬆半琥珀酸鹽（中國北京的國家食品藥品監督管理局）。細胞培養(yang) 基及其補充劑均從(cong) Life Technologies（美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德）購買(mai) 。HepaRG細胞培養(yang) 在37°C和5% CO2條件下，每隔一天更換一次培養(yang) 基。通過在HepaRG培養(yang) 基中培養(yang) 細胞兩(liang) 周以誘導HepaRG細胞分化，達到貼壁生長。然後添加含2%二甲基亞(ya) 碸（DMSO; Sigma-Aldrich; 美國密蘇裏州聖路易斯）的分化培養(yang) 基再培養(yang) 兩(liang) 周。HHSteC細胞在從(cong) ScienCell研究實驗室（美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德的ScienCell）購買(mai) 的星形細胞培養(yang) 基中擴展。細胞在貼壁生長達到80%時收獲用於(yu) 進一步共培養(yang) 。

人類肝球體(ti) 的形成按照Wagner等人之前的描述進行。簡單地說，每個(ge) 384孔球體(ti) 板孔中放置50μl含0.1×104HHSteC細胞和2.4×104 HepaRG細胞的細胞懸液（Corning Costar, 美國肯納邦克）。細胞在CO2孵化器中的搖床上培養(yang) 3天，形成圓形且緊湊的球體(ti) 。然後將球體(ti) 轉移到超低附著力24孔板（Corning Costar, 美國肯納邦克）。收集40個(ge) 球體(ti) 形成一個(ge) 2-OC係統的單一肝等價(jia) 物。在EVOS XL Core數字倒置顯微鏡（Life Technologies, 美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德）下評估分化的HepaRG細胞的形態和肝球體(ti) 的形成。

腎近曲小管屏障模型建立：RPTEC/TERT1細胞在添加了2 mM GlutaMAX、10,000 U/ml青黴素、10,000 μg/ml鏈黴素、36 ng/ml氫化可的鬆、5 μg/ml人胰島素、5 μg/ml轉鐵蛋白、5 ng/mlXI酸鈉（ITS 1×）、10 ng/ml人表皮生長因子（hEGF）的DMEM和Ham’s F-12 （DMEM/F12）培養(yang) 基中培養(yang) 。培養(yang) 基和補充劑均從(cong) Life Technologies（美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德的Life Technologies）購買(mai) 。氫化可的鬆從(cong) Sigma-Aldrich（美國聖路易斯的Sigma-Aldrich）購買(mai) 。
        每個(ge) Transwell可滲透支架種植100,000個(ge) RPTEC/TERT1細胞，並允許它們(men) 在夜間附著。然後，更換上室的培養(yang) 基以移除未附著的細胞。在實驗前，種植的支架在2-OC中靜態培養(yang) 4天，灌流條件下培養(yang) 3天。在2-OC內(nei) ，將插入膜定位在培養(yang) 室底部上方100 μm的位置，以確保介質在近曲小管屏障下自由通過。使用EVOS XL Core數字倒置顯微鏡（Life Technologies, 美國加利福尼亞(ya) 州卡爾斯巴德的Life Technologies）監測RPTEC/TERT1的細胞形態和分化。

基於(yu) 芯片的共培養(yang) ：實驗使用十四個(ge) 2-OC係統，共培養(yang) 在500微升循環培養(yang) 基中，屏障插件頂部添加100微升培養(yang) 基。排泄池中的培養(yang) 基每天更換。循環上清的一半被替換並收集。在16天共培養(yang) 結束時，通過免疫熒光和qRT-PCR分析肝髒或近曲小管等價(jia) 物的器官特異性功能標誌物。芯片上的微泵設置頻率為(wei) 0.8 Hz，從(cong) 而產(chan) 生的流速不超過9微升/分鍾。

實驗試劑：CsA（CAS號：59865-13-3）被添加到重複劑量的共培養(yang) 中進行測試。RFP（CAS號：13292-46-1）與(yu) CsA同時給藥。對於(yu) 儲(chu) 備液，CsA和RFP（中國國家食品藥品監督管理局-北京）溶解在DMSO中，在4°C暗處儲(chu) 存，使用時稀釋到最終濃度0.1%的DMSO。

藥物暴露於(yu) 肝髒-腎髒共培養(yang) 芯片：在三天無藥物適應性共培養(yang) 後，CsA儲(chu) 備液被稀釋至相應濃度的新鮮培養(yang) 基中，10 µM（低劑量）和20 µM（高劑量），並每日給藥13天。在聯合給藥組中，每天給予20 µM CsA，直到第6天，然後從(cong) 第6天到第13天每天同時給予20 µM CsA和25 µM RFP。含0.1% DMSO的培養(yang) 基用於(yu) 對照培養(yang) （見圖1C）。

共培養(yang) 分析：上清樣本：細胞活力通過每日測量肝髒和近曲小管屏障隔室中的上清液的乳酸脫氫酶（LDH）活性來監測。代謝活性通過使用乳酸比色測定試劑盒（Biovision, 美國加州米爾皮塔斯）根據生產(chan) 商的說明書(shu) ，每日測量兩(liang) 個(ge) 隔室上清液中的葡萄糖和乳酸水平來檢測。在第1天、第7天和第14天，使用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析代用血循環中CsA和RFP的濃度，並檢測兩(liang) 個(ge) 隔室上清液中的毒性生物標誌物。包括LDH、葡萄糖、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-穀氨酰轉肽酶（GGT）、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺苷酶（NAG）、總膽紅素（TBiL）、白蛋白（ALB, 血清）、肌酐（CRE）和尿素（UREA）的生物標誌物的檢測，使用日立7180自動生化分析儀(yi) （日本）進行。上述標記的試劑盒從(cong) Wako（日本）購買(mai) 。骨活素（OA）、穀胱甘肽-S-轉移酶α（GST-α）、KIM-1、脂肪酸結合蛋白-1（FABP-1）、IV型膠原（Col IV）、中性粒細胞明膠酶相關(guan) 脂鈣蛋白（NGAL）、集落素（Clu）、胱抑素C（Cys C）、腎素（REN）、α1-微球蛋白（α1-MG）、骨橋蛋白（OPN）、中性粒細胞明膠酶相關(guan) 脂鈣蛋白（NGAL）、鈣結合蛋白（CALB）、金屬蛋白酶組織抑製劑-1（TIMP-1）、幹擾素誘導蛋白-10（IP-10）、三葉因子-3（TFF-3）、表皮生長因子（EGF）和尿白蛋白的測定使用的是Merck Millipore（美國馬薩諸塞州比勒瑞卡）的MILLIPLEX MAP人類腎損傷(shang) 磁珠板1和2。根據生產(chan) 商的指導，這些檢測在美國德州的Luminex 200上執行。數據通過MILLIPLEX Analyst 5.1軟件（美國馬薩諸塞州比勒瑞卡）分析。

給藥前後進行組織培養(yang) 分析：含RPTEC/TERT1細胞的肝球體(ti) 和膜被冷凍在O.C.T.化合物中，並儲(chu) 存在-80°C直至進一步分析。為(wei) 了染色，切片先用-20°C的丙酮固定10分鍾或4%的PFA固定10分鍾。然後，細胞用0.05%的Triton X-100滲透處理，清洗並用10%的山羊血清封閉30分鍾，隨後用針對CYP3A4、BSEP、CK8/18、MRP-2、Na+-K+-ATP酶、P-gp、VIM、ZO-1、CLDN 10 和Ki67（所有來自Abcam，美國馬薩諸塞州劍橋）的一抗在4°C過夜或常溫下孵育2小時，或使用乙酰化微管蛋白（來自Sigma-Aldrich, 美國密蘇裏州聖路易斯）孵育。之後，切片清洗三次，繼續與(yu) 熒光標記的二抗在常溫下孵育1小時。核用DAPI（Sigma-Aldrich, 美國密蘇裏州聖路易斯）進行染色。
        增殖和凋亡通過TUNEL/Ki67的免疫熒光染色進行分析。簡而言之，切片使用TUNEL技術（ApopTag1 過氧化物酶原位凋亡檢測套裝，Merck Millipore, 德國達姆施塔特）按照生產(chan) 商的指導進行染色。核用DAPI進行對染。所有的免疫熒光圖像均使用尼康Eclipse 80i數字熒光顯微鏡（日本東(dong) 京）和奧林巴斯IX 71倒置顯微鏡（日本東(dong) 京）配合Image-Pro Plus軟件（版本6.0, Media Cybernetics Inc., 美國馬裏蘭(lan) ）獲取。
         肝球體(ti) 和近曲小管細胞中的總RNA使用RNeasy@ Micro Kit（Qiagen, 德國杜塞爾多夫）提取。cDNA合成使用FastQuant RT Kit（含gDNase）（Tiangen Biotech; 中國北京）。qRT-PCR擴增在Line Gene 9620模型FQD-96A（Bioer）上進行，使用SYBR Green檢測（Tiangen Biotech; 中國北京）。程序根據套件的生產(chan) 商指導書(shu) 及設備中包含的軟件執行。數據分析使用軟件版本2.0.6進行。mRNA水平的變化通過2-ΔΔCT方法確定。引物由Sangon Biotech（中國北京）購買(mai) 。TBP和β-actin是肝球體(ti) 和近曲小管屏障的內(nei) 參基因。目標基因的引物序列在補充材料表1中顯示。

統計分析：統計評估使用GraphPad Prism（版本6.0，美國加州聖地亞(ya) 哥）和SPSS（版本17.0；IBM，美國紐約阿蒙克）進行。P值通過單向方差分析後，學生t檢驗計算得出。所有實驗均進行了三次重複（對照組和低劑量組）或四次重複（高劑量和聯合給藥組）。除非另有說明，所有數據均以均值 ± 標準誤差呈現。

Received: 18 November 2019; Accepted: 15 April 2020

Published: 1 June 2020