微生理係統監測Transwell上的三維小腸模型

Tissue-on-a-Chip: Microphysiometry With Human 3D Models on Transwell Inserts

微生理測量已被證明是用於(yu) 監測活細胞能量代謝以及細胞間相互作用的有利工具，該技術之前主要用於(yu) 監測二維細胞層。最近，我們(men) 的研究小組發現，微生理測量也可以自動檢測皮膚3D培養(yang) 物的胞外酸化速率和跨上皮電阻值(TEER)，該培養(yang) 物是培養(yang) 在3D打印的封閉的生物芯片之中來維持氣液界麵(ALI)。在這項工作中，我們(men) 提出了一種優(you) 化的多通道芯片用於(yu) 監測商品化的3D小腸組織模型的TEER。實驗持續1天，60分鍾為(wei) 重複周期，每個(ge) 周期包括三個(ge) 階段：(1)維護氣液界麵(ALI)；(2)加入測量培養(yang) 基或者試驗物；(3)清洗。初始平衡8小時後，加入細胞毒性和屏障破壞的化學物質（0.2%十二烷基硫酸鈉），導致TEER隨時間變化逐步降低，而以前傳(chuan) 統的細胞毒性測量方法是無法監測到這種變化的。這項工作證實了使用自動氣液界麵(ALI)的多通道實時監測三維腸模型的TEER的可行性。培養(yang) 的人體(ti) 組織結合智能移動檢測技術，為(wei) 在體(ti) 外診斷提供了一個(ge) 非常有前景的研究工具，特別是在毒理學，細胞代謝研究，藥物吸收等研究領域。

Keywords: microphysiometry, transepithelial electrical resistance, label-free monitoring, intestinal model, automated air–liquid interface

INTRODUCTION

盡管在藥物開發的臨(lin) 床前階段進行了完整的試驗，但未發現的毒性依然是臨(lin) 床階段失敗的一個(ge) 常見原因（Kola and Landis, 2004; Marx et al., 2016）。藥物毒性的研究之中，重要的一點就是要考慮小腸的吸收效應。臨(lin) 床前體(ti) 內(nei) 評估通常依靠小鼠或大鼠模型來代表人類特征（Le Ferrec et al.， 2001）。然而，齧齒動物模型不能可靠地預測藥物對於(yu) 人體(ti) 的各個(ge) 方麵的效應，所以就可能出現對藥物毒性或再吸收的錯誤評估。因此，近年來的研究重點已轉移到改善體(ti) 外毒性研究。

在體(ti) 外研究可重複性和分離影響變量的能力（Ferrick et al., 2008），有助於(yu) 更好地理解毒性機製。但是2D細胞培養(yang) 和細胞係（Leonard et al., 2010; Ayehunie et al., 2018）有限的生理相關(guan) 性和細胞培養(yang) 實驗中缺乏全自動分析的問題已經在之前的文獻中討論過（Gómez-Sjöberg et al., 2007; Meyvantsson et al., 2008; Li et al.,2013）。 3D細胞培養(yang) 領域的最新進展解決(jue) 了這些局限性，並提供了新的模型來增強對新藥安全性和有效性的信心（Fang and Eglen, 2017; Park et al., 2018）。采用“組織芯片"方法，通過體(ti) 外培養(yang) 的組織和器官模型，來改進對吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的評估（Madden et al., 2018）。

從(cong) 結腸（大腸）癌中提取的Caco-2單層細胞是一種廣泛應用於(yu) 體(ti) 外藥物吸收和毒性評估的細胞係，它可以代表三個(ge) 吸收途徑：跨細胞（細胞內(nei) 途徑）、細胞間（細胞外途徑）和載體(ti) 轉運。但是，細胞係和小腸組織的相關(guan) 性有限。文獻中（Shah et al., 2006）已經描述，它隻能預測跨細胞（細胞內(nei) 途徑）滲透。此外，貼壁培養(yang) 的單層Caco-2培細胞缺乏細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，不能模擬人小腸的多層複雜結構。為(wei) 了克服這種生理相關(guan) 性的不足，科學家開發了新的三維重建人體(ti) 組織模型（Li et al., 2013; Ayehunie et al., 2018）。在空氣-液體(ti) 界麵（ALI）上培養(yang) 三維小腸器官模型，彌補了體(ti) 外培養(yang) 的2D的形態學缺陷（Nossol et al.，2011）。

使用體(ti) 外組織培養(yang) 進行藥物效應分析的常用方法需要很多重複的組織樣本，還有繁瑣複雜的實驗步驟。方法和測量的複雜性導致需要大量的人工以及細胞或組織相關(guan) 的硬件設備，而這些又有可能導致細胞損傷(shang) ，增加結果的誤判（Blume et al.， 2010）。

相對手動測試，實時自動分析細胞存活率是一種更優(you) 化的測量吸收和毒性的方案。此外，有了實時監測的數據，就可進行短期和長期的分析。對於(yu) 長期的監測，自動化設備取代人工更換培養(yang) 基和添加試劑，以提高實驗的通量和重複性（Kempner and Felder, 2002）。總之，對細胞培養(yang) 進行實時連續測量可以同時觀察到多個(ge) 細胞代謝參數，並且支持ALI培養(yang) 的自動化微流控係統。我們(men) 在該研究中提出了這樣的一個(ge) 測試係統：組織芯片（tissue-on-a-chip）結合ALI培養(yang) 細胞（圖1）。通過生物芯片以及3D打印封閉的培養(yang) 腔體(ti) 成功培養(yang) 了3D重建人類小腸模型。

  在這項工作中，我們(men) 提出了一個(ge) 三通道、全自動的組織芯片測量係統（IMOLA-IVD，德國cellasys），該係統可以測量跨上皮細胞電阻（TEER），進一步深入了解上皮細胞層的組織形態和屏障特性。值得注意的是，與(yu) 之前描述的單通道芯片係統相比，該係統在三個(ge) 通道中都有一個(ge) 自動的ALI，使用的細胞培養(yang) 基更少（Alexander et al., 2018）。因此，現可以一次在三個(ge) 的芯片上進行平行實驗，例如：測試物，對照和空白。

MATERIALS AND METHODS

Human 3D Tissue Model

實驗采用重建的三維腸組織—EpiIntestinal-FT。這個(ge) 基於(yu) 人體(ti) 細胞的3D組織整合了腸上皮細胞、Paneth細胞、M細胞、簇細胞和小腸幹細胞以及人小腸成纖維細胞，它被培養(yang) 在ALI模擬生理條件之中。EpiIntestinal-FT模型可以用來表征小腸功能的不同方麵，包括屏障功能、代謝、炎症和毒性反應（Ayehunie et al ., 2018）。

Microphysiometric System

德國cellasys公司的IMOLA-IVD是一個(ge) 由自動化微流控係統擴展的微生理測量係統（Brischwein和Wiest, 2019）。該設備的詳細設置在之前的報告中有描述（Weiss et al.， 2013）。簡單地說，就是生物芯片上裝有兩(liang) 個(ge) 交叉電極結構的電阻傳(chuan) 感器、兩(liang) 個(ge) 電化學的pH傳(chuan) 感器、一個(ge) 電流的測氧傳(chuan) 感器和一個(ge) 溫度傳(chuan) 感器。來自傳(chuan) 感器的測量數據被數字化記錄並傳(chuan) 輸到計算機上的專(zhuan) 有軟件—Data Acquisition and Link Application（DALiA）軟件。該軟件負責流體(ti) 的數據的處理和流路的控製，使用一個(ge) 定製化的開/關(guan) 協議，以控製蠕動泵和微流控係統（雙向交界處的閥門）。使用這些工具可以並行監控6通道IMOLA-IVDs同時獲得實時數據進行對比分析，例如測試物和陰性/陽性對照通道。

為(wei) 了更好地使用和維護IMOLA-IVD和ALI，Alexander et al（2018）開發了一種新的封閉的培養(yang) 腔設計，用Ultimaker 3D打印機打印的聚交酯並粘在生物芯片上。有了這種封閉的培養(yang) 腔，就可以產(chan) 生兩(liang) 條不同的微流道：一條在培養(yang) 腔頂端，一條是培養(yang) 腔側(ce) 麵。通過一根頂端金電極和一根側(ce) 麵金電極傳(chuan) 感器可以測量在Transwell半透膜小室上培養(yang) 的三維組織的TEER。

測量TEER的頻率為(wei) 10kHz，外加電壓為(wei) 30mv。結合密封腔的生物芯片和用於(yu) 根尖線的射流頭如圖1所示。結合封裝的生物芯片和流路通道，如圖1所示。完整的設置如圖2所示。IMOLA suppo係rt 統(ISS-3)包括為(wei) IMOLA係統、用於(yu) 控製流路係統的閥門的開關(guan) ，以及用於(yu) 記錄氣泡探測器數據的電子設備等提供電源。

DALiA客戶端軟件應用程序用於(yu) 控製測量和記錄的數據。泵、流路模塊和細胞培養(yang) 液等IMOLA係統都被安裝在通用的細胞培養(yang) 箱內(nei) ，保證整個(ge) 實驗都在37◦C。三個(ge) 通道中的每一個(ge) 都有兩(liang) 條流路，一條是頂端，一條是側(ce) 麵，如圖3所示。兩(liang) 種流路都可用於(yu) 將多種物質注射到細胞環境之中，如培養(yang) 基和測試物。在這篇文章中，頂端流路可以引入兩(liang) 種不同的物質：基礎培養(yang) 基和測試物。在TEER測量過程中，在培養(yang) 的組織的頂端加入LBM低緩衝(chong) 培養(yang) 基，從(cong) 而在頂端和基底側(ce) 麵（液體(ti) 界麵）之間建立一個(ge) 導電連接。另外，頂端覆蓋了一層薄薄的培養(yang) 基（空氣界麵）（200nm）。基底側(ce) 麵流路定期向培養(yang) 的組織的基底外側(ce) 注入新的營養(yang) 物質。在本研究中，流路係統的連接如圖3所示。1號閥用於(yu) 更換頂端培養(yang) 基；2號閥負責插入的培養(yang) 小室的頂端的填充或排空；3和4號閥門分別將頂端和基底側(ce) 麵的培養(yang) 基注入到生物芯片或廢液瓶中，5和6號閥門交替切換到過濾的空氣。一個(ge) IMOLA-IVD使用6個(ge) 閥門和單向模式控製的4個(ge) 泵通道。這裏展示的裝置使用三個(ge) IMOLA-IVD模塊平行地研究三個(ge) 培養(yang) 小室（三個(ge) 生物芯片，每個(ge) 都有一個(ge) 頂端和一個(ge) 基底側(ce) 麵）。

Assay Preparation for Verification

為(wei) 驗證流路係統的設置和測量，可以用磷酸緩衝(chong) 液（PBS）做預實驗。對於(yu) 頂端和基底側(ce) 麵，使用滲透壓為(wei) 300±10% mOsmol/kg的PBS溶液，通過頂端通道的試驗物質為(wei) 1000±10% mOsmol/kg的PBS溶液。

Assay Preparation for the EpiIntestinalTM Model

開始前，先將組織進行預培養(yang) 以穩定狀態。然後注入5 ml 基底側(ce) 麵培養(yang) 基 SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)；頂端加入200 μl 的SMI-100-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories) ；然後在 37◦C和5% CO2培養(yang) 箱至少培養(yang) 24 小時。實驗前，對整個(ge) 係統進行滅菌和培養(yang) 液預灌流。所有管道和頂端通過2.5%的次氯酸（Sigma Aldrich, #71696, diluted with double-distilled H2O）消毒20分鍾進行滅菌處理，生物芯片密封腔是通過浸潤在70%乙醇20分鍾進行滅菌處理。隨後，基底側(ce) 麵和頂端注入培養(yang) 基，對管道進行預灌流處理。將整個(ge) 係統和培養(yang) 基放置在37◦C和5% CO2培養(yang) 箱之中過夜。最後，將含有小腸組織的培養(yang) 小室放置在經滅菌處理的生物芯片上。基底側(ce) 麵流路使用

SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)。頂端流路使用無緩衝(chong) DMEM (cellasys GmbH, Kronburg, Germany: SOP-G200-006; see supplement material) 和溶解在 DMEM之中的測試物。

最後使用濃度為(wei) 0.2或2.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)作為(wei) 破壞3D小腸組織屏障的物質。在預先設定的灌流周期內(nei) ，確定了兩(liang) 個(ge) 流體(ti) 通道的時間順序。TEER測量周期包括：35分鍾ALI，10分鍾TEER測量和15分鍾的清洗周期。第一個(ge) ALI周期用於(yu) 流體(ti) 係統的內(nei) 部預灌流，將程序設定為(wei) 每個(ge) 循環為(wei) 1小時，持續灌流24小時。第8小時，將頂端培養(yang) 基更換為(wei) 含0.2% SDS的培養(yang) 基，循環一個(ge) 周期，然後更換為(wei) 不含SDS的培養(yang) 基。

RESULTS

Verification of the Measurement Procedure and the Fluidic System

每個(ge) TEER測量周期由測量階段和衝(chong) 洗階段，循環程序的一致性可以確保整個(ge) 監測期間的變化肯定是由待測物引起的。每次TEER測量開始時，培養(yang) 小室的頂端為(wei) 空的，慢慢填充相應的培養(yang) 基。一旦達到足夠體(ti) 積，TEER電極被浸沒在相應的培養(yang) 基之中，並開始夠測量電阻。使用PBS溶液進行係統驗證的方法如圖4。TEER的振幅的最終標準值是244Ω。隨後加入測試物，電導率與(yu) PBS相比有所增高，電阻的振幅的準值下降到132Ω。重新注入PBS後稀釋待測物，再吸出。如果沒有第二次注入PBS，測試物將一直保留在培養(yang) 環境之中，持續影響細胞。如圖4所示，需要兩(liang) 次清洗的循環才能除去測試物。結果表明，IMOLA-IVD裝置的灌流係統和傳(chuan) 感器的在整個(ge) 測量過程之中工作正常。因此可得出結論，傳(chuan) 感器是精確穩定的，振幅變化對應於(yu) 注入的PBS滲透壓的變化。

Control Experiments

為(wei) 了驗證該設置，在一個(ge) IMOLA上設計了一個(ge) 帶有正負對照的測試實驗。在不添加任何物質的情況下監測小腸組織的TEER值20小時（陰性對照），然後在2.0%SDS的影響下監測20-28小時（陽性對照）。TEER測量每小時進行一次。在每個(ge) 測量周期中，TEER值可以用

PBS測量後期的平台期的平均值來表示，如圖4所示。這些平台期的平均值被整合成一個(ge) 連續的TEER數據圖。圖5顯示了TEER值的大小和相位（左）以及實部和虛部（右）。

TEER值通常隻顯示大小,但是，為(wei) 了顯示所有的測量值，測量的阻抗在兩(liang) 種常用坐標係中充分顯示，即在極坐標下（左）表示大小和相位，在笛卡爾坐標下（右）表示實部和虛部。其數學表達式如公式1所示：

Tissue-on-a-Chip Model

Figure 6 加入0.2% SDS 的腸組織模型。經過開始的5小時，TEER達到270Ω的平均值。第8小時加入測試物SDS，TEER迅速上升，隨後線性降低，在第18小時降到到225Ω。需要注意的是，SDS不會(hui) 改變細胞培養(yang) 基的滲透壓濃度。測定的0、0.2和2.0% SDS的培養(yang) 基的滲透壓濃度 (OSMOMAT 030, Gonotec, Berlin, Germany) 基本一致(300±5% mOsmol/kg)。

CONCLUSION

在這裏，我們(men) 提出了原理證明實驗使用三通道微生理測量係統測量重建腸上皮模型的TEER與(yu) ALI。參數的測量是非侵入性的、實時的，並且係統定期自動更新培養(yang) 基。在TEER測量中，培養(yang) 小室的頂部也注入培養(yang) 基。PBS和2.0% SDS的驗證實驗也證實了該測量方法和係統。

8 h後加入測試物（0.2% SDS）後發現TEER呈下降趨勢。在未來的工作中，我們(men) 建議進行後續實驗，使用測試物和微傳(chuan) 感器來獲取pH值和溶解氧的數據(Wiest et al.，2016)。

總的來說，IMOLA-IVD係統已被證明是一種靈靈活、可定製的係統，用於(yu) 分析各種細胞培養(yang) 物模型，包括貼壁的2D細胞係，3D球狀體(ti) ，以及用於(yu) 重構人類表皮和腸的組織/類器官芯片。未來的工作將包括研究和優(you) 化灌流循環(例如，增加測試物質之前的穩定期的時間)和電極幾何形狀，以及光譜測量信息的收集（Gilbert et al., 2019; van der Helm et al., 2019），以建立一種可用於(yu) 肺或其他粘液細胞模型的多功能的組織芯片的研究工具。

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The datasets generated for this study are available on request to the corresponding author.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

All authors listed have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and approved it for publication