微生理係統實時監測皮膚類器官

類器官代謝分析儀(yi) ：微生理係統實時監測跨上皮細胞層電阻和細胞外酸化率

Skin-on-a-Chip：Transepithelial Electrical Resistance

And Extracellular Acidification Measurements

Through an Automated Air-Liquid Interface

皮膚是人體(ti) 重要的器官，在保護人體(ti) 內(nei) 部起著至關(guan) 重要的作用。因此，人們(men) 進行了大量的工作來創建人造表皮模型進行體(ti) 外皮膚毒性試驗。這些組織模型被稱為(wei) 重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE），被用於(yu) 在製藥、化妝品和環境領域中評估皮膚暴露於(yu) 外源性物質中的毒性研究。在這裏，我們(men) 提出了一個(ge) 無標記的方法，即利用了intelligent lab for in vitro diagnostics（IMOLA-IVD）一個(ge) 無創、基於(yu) 傳(chuan) 感器的平台，來檢測多孔膜上RhE細胞模型和貼壁細胞的跨上皮細胞層電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）。首先在聚碳酸酯膜上培養(yang) 小鼠成纖維細胞作為(wei) 測試模型，使用定製的生物芯片封閉式設計，以及雙微流道結構，用於(yu) 培養(yang) 物的連續和自動灌流。檢測L929細胞的胞外酸化率（Extracellular acidification rate，EAR）和跨上皮細胞層電阻（transepithelia lelectrical resistance，TEER）。通過該平台監測RhE細胞模型的TEER超過48小時。TEER和EAR測試表明，該平台可以長時間穩定培養(yang) 芯片上的皮膚細胞模型，監測代謝參數，以及組織降解。        

Keywords：TEER；Organ-on-a-Chip；skin models；reconstructed human epidermis；impedance；label-free monitoring

1.       INTRODUCTION

作為(wei) 人體(ti) 最大的器官，皮膚代表著人體(ti) 內(nei) 部和外部環境之間的結構學屏障，將體(ti) 內(nei) 器官與(yu) 毒素、病原體(ti) 隔離開來，並保護內(nei) 部器官免受紫外線（UV）輻射。除了重要的屏障功能，人體(ti) 皮膚還執行人體(ti) 的幾個(ge) 基本功能，如熱調節、感覺和排泄。因為(wei) 皮膚是人類抵禦外部環境的影響的第一防護罩，新的化學物質的研究，如藥物和毒素，必須分析和評估其對調節皮膚完整性的能力。調查在這些化合物的影響下，細胞生物學利用細胞培養(yang) 模型，更深入的研究了解由化學物質調節的細胞行為(wei) 。在過去的十年裏，科學家開發了各種生物工程模型用於(yu) 皮膚毒性研究。第一個(ge) 皮膚模型基於(yu) 傳(chuan) 統的二維（2D）共培養(yang) 模型，角質細胞接種到培養(yang) 好的成纖維細胞上。由於(yu) 在剛性塑料上培養(yang) 不能長時間維持上皮細胞，而且阻止了細胞分層，組織工程界開發了3D皮膚模型來再現體(ti) 內(nei) 類似結構，並通過整合氣液界麵設計了一個(ge) 更具有生理相關(guan) 性的環境。

人的皮膚由下列初級層組成，它們(men) 具有附屬的功能：表皮層、真皮層和皮下組織。將不同皮膚層整合到細胞模型中，目前的皮膚模型可分為(wei) 含角質細胞的重建人表皮模型、含角質細胞和成纖維細胞的代表真皮和表皮隔層的全層模型，以及帶有額外細胞類型（如黑素細胞、幹細胞等）的全層模型。由於(yu) 其結構簡化，重新建立人表皮（RhE）模型具有較高的重現性，因而被廣泛接受。RhE細胞模型由人源性角質細胞接種在聚碳酸酯半透膜上，並將其納入細胞培養(yang) 係統，置於(yu) 標準孔板中，如商業(ye) 化的Transwell®係統（Corning Inc.，Corning，NY，USA）。該裝置將培養(yang) 物放置在氣液界麵，皮膚表麵暴露在空氣中，形成生理環境類似的培養(yang) 條件。目前，有開放的皮膚模型，以及商業(ye) 的模型，如EpiDerm™（MatTek in vitro life science laboratories, Bratislava, Slovak Republic），EpiSkin™（EpiSkin, Lyon Cedex, France），SkinEthic™（EpiSkin），EpiCS®（CellSystemsGmbH，Troisdorf，Germany），和LabCyte（Japan Tissue Engineering Co., Ltd. [J-TEC], Aichi, Japan）。ALEXANDRA協會(hui) 遵循非營利性的方法，為(wei) 製作和測試開放的3D皮膚模型提供了方案。

2. Background

2.1. 基於(yu) 重構人表皮的皮膚毒性試驗的最新進展

從(cong) 監管角度來看，評價(jia) 和預測有毒化合物和藥物對皮膚的有害影響，3D模型係統必須經過一係列廣泛測試化合物的驗證。如果通過歐洲替代方法驗證中心 （ECVAM） 證實和經濟合作與(yu) 發展組織（OECD）測試指南（TG），具有測試技術的模型就可以作為(wei) 可接受的工具用於(yu) 皮膚毒性測試。到目前為(wei) 止，OECD提供了用於(yu) 皮膚腐蝕和刺激的指南測試的指南，分別基於(yu) OECD TG 431和439。

2.2.器官芯片平台和微生理測量

由於(yu) 目前的模型在生物學的相關(guan) 性上，隻提供有限的意義(yi) ，所以毒理學領域測試正朝著實現器官芯片（Organ-on-Chip，OOC）儀(yi) 器的方向發展。器官芯片係統描述了一種包含灌注小室的微流體(ti) 細胞培養(yang) 裝置，在生理相關(guan) 條件下培養(yang) 活細胞。然而，大多數OOC平台仍然嚴(yan) 重依賴端點分析方法，缺乏的不同時間點的測試方法。此外，化學標簽，如熒光標簽可能會(hui) 潛在地影響細胞代謝從(cong) 而改變實驗結果。因此，采用無標簽技術的實時讀數的集成設備，對於(yu) 測量進行空間和時間解析的是非常有意義(yi) 的。

２.３. 皮膚/重建人表皮的跨上皮細胞層電阻

由於(yu) 潛在的有害化合物會(hui) 影響皮膚厚度，厚度的測量也是早期研究的參數之一。破壞性測量，例如活組織檢查，或非破壞性測量，如共焦拉曼光譜儀(yi) 和超聲波成像。其中方法和有用的細胞培養(yang) 的應用就是測量皮膚通透性屏障，以評估上皮或內(nei) 皮組織的活力和功能。在這裏，跨上皮細胞層電阻（TEER）提供了一種無標記和快速的技術來研究皮膚完整性。TEER值代表了一層或幾層細胞層的電阻值。

２.４. 目前跨上皮細胞層電阻測量的缺點和跨上皮細胞層電阻自動化測量的需要

除了微加工方法，還有一些商業(ye) 上可用的外部測試係統，如“伏特-歐姆計"（World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）,，它可以現成的。由於(yu) 缺少與(yu) 細胞培養(yang) 係統的整合，研究人員需要手動將細胞培養(yang) 物從(cong) 生物培養(yang) 箱放到測量係統。這個(ge) 過程缺乏重現性和標準化，也不能提供高通量測量的能力。雖然下一代的電極室（如Endohm室）可以直接測量，但是培養(yang) 基以及試劑都必須手動加入，用於(yu) 長期培養(yang) 和藥物研究案例。因此，擴展的研究是不可能的，因為(wei) 舊的介質不能從(cong) 培養(yang) 係統中取出，也沒有自動灌注新鮮的培養(yang) 基。總而言之，目前的TEER測量係統仍然嚴(yan) 重依賴手動操作和手持式係統，影響了測量的穩定性，從(cong) 而影響了整體(ti) 實驗的再現性。經濟合作與(yu) 發展組織（OECD）認為(wei) ，一個(ge) 可接受的測試方案，分析重現性是驗證中的一個(ge) 基本標準。因此，TEER領域通過集成自動TEER監控和采集，係統能夠在培養(yang) 基頻繁變化的情況下執行編程模式測量，也非常有意義(yi) 。

在此，我們(men) 介紹了一種新的自動監測測試和采集數據的微生理測量係統（IMOLA-IVD，德國cellasys）用於(yu) TEER測量。通過一個(ge) 密封設計的商業(ye) 化，用聚碳酸酯膜培養(yang) 的表皮細胞RhE細胞模型。應用TEER測量用於(yu) 研究RhE培養(yang) ，並集成到自動化的流體(ti) 平台，可以精確灌注培養(yang) 基和加藥。此外，我們(men) 能夠監測細胞外酸化率（extracellular acidification rate， EAR）。實證研究的目的是通過集成自動化灌流係統和集成測試平台，實現實時動力學測量，同時保證測量穩定性。本研究演示了一種評估皮膚完整性的無創的測量方法的驗證和應用。

3．Materials and Methods

3.1. 體(ti) 外診斷智能移動實驗室概述  

IMOLA-IVD是一種芯片上的實驗室測量係統，用於(yu) 自動監測L929小鼠成纖維細胞和EpiDerm™重建人表皮細胞模型的TEER和EAR。IMOLA-IVD的基本操作已經在之前的工作中進行了描述，簡單地說，每個(ge) IMOLA-IVD包括一個(ge) 電源、模擬和數字模塊，以及一個(ge) 集成了傳(chuan) 感器的生物芯片，該傳(chuan) 感器被動地監測細胞模型的微環境。標準的IMOLA-IVD實驗是通過裝載數據采集和鏈接應用DALiA 2.0軟件的個(ge) 人計算機實現自動化的，以控製一個(ge) 蠕動泵和連接6個(ge) IMOLA-IVD係統的微流控通路。泵在ON和OFF狀態之間循環。在OFF泵關(guan) 閉周期，細胞能夠代謝培養(yang) 基中的營養(yang) 物質；在ON泵打開周期，營養(yang) 豐(feng) 富的培養(yang) 基被灌流到細胞中。

3.2 改進的BioChip-D小室

生物芯片模塊包含一個(ge) 傳(chuan) 感器芯片連接到電路板並連接到一個(ge) 圓柱形密封小室，用以保護芯片的連接並連通細胞及培養(yang) 基。一個(ge) 流體(ti) 頭直接連接密封小室，形成一個(ge) 液體(ti) 密封、靜態微容積（~ 6μL）的反應室，在集成的傳(chuan) 感器表麵測量細胞外酸化率（EAR）和氧合作用 （圖1a）。然而，需要測量RhE的情況下，多孔膜上培養(yang) 的細胞不適合標準生物芯片或標準的IMOLA-IVD叉指電極傳(chuan) 感器（IDES）測量電阻。為(wei) 了克服這些限製，新的密封小室和流體(ti) 頭的設計，以保持空氣-液體(ti) 使用Pro/Engineer Wildfire 4.0 （PTC Inc., Needham, MA, USA）。密封用Ultimaker 2 （Ultimaker BV，Geldermalsen，Netherlands），使用聚乳酸（PLA）和矽橡膠醫用粘合劑（Corning Inc., New York, NY, USA）連接到生物芯片BioChip。重新設計的BioChip小室適用於(yu) 擴大培養(yang) 室和其他多孔膜上培養(yang) 的細胞（圖1b）的RhE。

3.3. L929細胞與(yu) 重建人表皮細胞的製備與(yu) 培養(yang)

記錄小鼠成纖維細胞（L929）和重建人表皮細胞（RhE）的跨上皮細胞層電阻值。L929細胞在加10%胎牛血清（FBS） 和10 μg/ml gentamycin （Thermo Fisher,Waltham, MA, USA）。細胞按照標準的實驗室規範（GLP）培養(yang) ，並保存於(yu) 37℃和5%的培養(yang) 箱中培養(yang) 後，在95%融合度時，細胞傳(chuan) 代，100,000細胞種在12mm Transwell®上，孔徑3 μm的多孔膜（Corning Inc.）。transwell隨後被放置在6孔板上，並在1ml DMEM中再孵育24小時，然後轉移到modified BioChip中。L929細胞是我們(men) 實驗室的標準細胞係，用於(yu) 驗證實驗。

將EpiDerm™RhE細胞模型轉移到6孔板上，並在5.5mm/5mL的MatTek無血清長期培養(yang) 基（#EPI-100-NMM-250） （MatTek in vitro life science laboratories）。每48小時交換一次培養(yang) 基，直到轉移到BioChips中TEER實驗。實驗開始前24 h，將培養(yang) 基減少到0.9 mL然後放在12孔板裏。Modified BioChip-D在70%乙醇中室溫滅菌處理20 min後，用無菌去離子水衝(chong) 洗。生物芯片灌流無緩衝(chong) DMEM處理24 h以穩定溫度，然後將膜培養(yang) 物放置在芯片上。

3.4. 自動化灌流係統的介紹

設計了一種自動灌流係統來自動化監測在生物芯片上培養(yang) 48小時以上的RhE細胞模型的TEER。該係統由兩(liang) 個(ge) 流體(ti) 模塊（FM）組成，通過與(yu) Tygon® E-3603 （ProLiquid GmbH, Ueberlingen, Germany）管道連接成獨立的管道。這些獨立的網絡通過IMOLA-IVD泵標準設置的ON/OFF開關(guan) 程序，向基底細胞提供營養(yang) 豐(feng) 富的細胞培養(yang) 基，並定期向Transwell®膜的頂部區域，泵入磷酸鹽緩衝(chong) 鹽溶液（PBS）。如圖2所示。培養(yang) 基流入模塊在無緩衝(chong) 的DMEM和0.2%SDS的培養(yang) 基之間切換，提供給膜底部的細胞。TEER測量模塊連接到PBS進行TEER測量或測試可用於(yu) 接種RhE表麵的水溶性測試物。

L929細胞培養(yang) 在多孔膜小室上，RhE細胞模型培養(yang) 在Modified BioChip-D上，通過無緩衝(chong) 的DMEM與(yu) 灌流泵進行36小時周期的培養(yang) 。對於(yu) L929細胞，為(wei) 監測細胞酸化，泵ON時間為(wei) 5分鍾，而泵OFF時間為(wei) 5分鍾、10分鍾、30分鍾和55分鍾。對於(yu) RhE細胞模型，泵周期為(wei) 5分鍾ON, 10分鍾OFF, 5分鍾ON, 25分鍾OFF, 5分鍾ON, 10分鍾OFF。在25分鍾的泵OFF階段，通過將PBS泵入膜頂部小室，在芯片上的電阻傳(chuan) 感器和流體(ti) 頭部的導線電極之間建立電路連接，記錄TEER測量。以60 μL/min的速度將750 μL的PBS泵到芯片上的膜上，然後以120μL/min的速度去除。TEER測量是在25分鍾泵關(guan) 閉期間進行的。在預定的穩定測量周期後（L929細胞和RhE細胞模型分別為(wei) 47和36小時），將0.2% SDS無緩衝(chong) DMEM泵入芯片作為(wei) 陽性對照。用SDS培養(yang) 基灌注至少12小時，以證實對照組對測得的TEER的影響。

4. Results and Discussion

4.1. 重新設計的經上皮電阻密封功能

將多孔膜插入培養(yang) 室，確定培養(yang) 室體(ti) 積為(wei) ~170 μL。匹配樣機通過膜下形成的入口孔灌注到腔內(nei) ，膜底部的孔允許新鮮營養(yang) 物質被動地擴散到細胞的基底層和細胞的廢物擴散出細胞。在泵ON循環期間，營養(yang) 消耗後的培養(yang) 基泵出腔室（圖2）。RhE培養(yang) 物的頂端表麵暴露於(yu) 環境空氣中，經過長時間的培養(yang) ，刺激分化成一個(ge) ALI的分層。為(wei) 了測量這些培養(yang) 物的TEER，重新設計的流體(ti) 頭包含一個(ge) 雙向的入口/出口閥，周期性地分配一定量的PBS溶液。這種方法連接多孔膜頂端腔的導線電極（見圖1b）和傳(chuan) 感器芯片上的平麵IDES電極之間的電路。溢流閥使TEER電極淹沒在穩定的培養(yang) 基體(ti) 積中，防止溢流。連續5分鍾記錄膜的TEER，然後在測量之後取出PBS以維持ALI。

4.2. 小鼠成纖維細胞的胞外酸化率的測定

使用自動測量程序實時測量EAR，將L929細胞生長在聚碳酸酯膜。用未緩衝(chong) 的DMEM以50 μL/min的速率灌注L929細胞。圖3顯示了在泵交替階段測量的pH值（以mV為(wei) 單位）。紅色條表示泵OFF階段，灌流新鮮培養(yang) 基，細胞活躍地將營養(yang) 物質代謝為(wei) 酸性廢物，生物芯片上的金屬氧化物傳(chuan) 感器會(hui) 檢測到這些代謝物。綠色條表示泵ON階段。在此階段中，膜底部灌注新鮮培養(yang) 基，提供營養(yang) 給膜上培養(yang) 的細胞。從(cong) 圖中可以看出，當培養(yang) 基酸化時，泵OFF階段55分鍾內(nei) ，電壓會(hui) 增加~5 mV，而較短的時間內(nei) 不會(hui) 產(chan) 生明顯的電壓變化。

4.3. 小鼠成纖維細胞對十二烷基硫酸鈉培養(yang) 基的代謝反應

一旦泵ON周期結束，測量的電壓迅速下降，直到達到基線（穩態）值。在下降之前存在一個(ge) 短暫的延遲，這可能是由於(yu) 新鮮培養(yang) 基與(yu) 芯片上已有的酸化培養(yang) 基之間的混合導致的，因為(wei) 出口的位置高於(yu) 進口。在58小時，測量的信號下降。這可能是由於(yu) 細胞膜破裂和細胞內(nei) 內(nei) 容物釋放到培養(yang) 基中。在56小時，細胞已經溶解，因此不會(hui) 產(chan) 生廢物酸化周圍的介質，導致在55分鍾泵OFF階段信號變平坦。圖4描述了在實驗持續時間55分鍾OFF階段持續測量EAR。可以看出，加入SDS後，EAR突增，然後迅速降至零以下，表明細胞裂解。然後它逐漸趨近於(yu) 零，直到實驗結束。

4.4. 小鼠成纖維細胞的TEER（跨上皮細胞層電阻）監測

除了監測L929細胞的代謝率，在25分鍾泵OFF期間還可以監測TEER值。在TEER測量過程中，隨著PBS泵入測量小室以連接電路進行測量，數值會(hui) 發生變化。TEER開始無數值，因為(wei) 電極對之間存在斷路。嵌入在流體(ti) 頭的導線電極浸入PBS中，與(yu) 膜下的芯片上的導電電極一起連接形成電路。PBS在細胞上停留5分鍾，泵OFF以進行穩定監測。然後PBS被泵出測量小室，直到下一個(ge) 測量循環。

圖4顯示了從(cong) 25小時開始測量的EAR和TEER。在泵OFF階段，EAR由線性回歸計算。表1總結了SDS加入前和加入後的結果。實驗開始24小時後，實測的實數電阻穩定在190歐姆附近，虛部電阻為(wei) -40歐姆。因為(wei) 已知L929小鼠成纖維細胞在培養(yang) 中保持單層，預計電阻將穩定在一個(ge) 低水平。暴露於(yu) 0.2% SDS培養(yang) 基8小時後（時間為(wei) 第 56小時），實數電阻下降14.8%，對應加入SDS導致的細胞死亡。虛部電阻下降6.11%。這些結果表明，開發的密封設計和泵模塊能夠進行自動化電阻測量。

4.4. RhE細胞模型的TEER（跨上皮細胞層電阻）監測

使用上述相同的設置對重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）進行連續監測TEER約50小時。在前12小時，TEER值保持相對穩定，如圖5所示。在36小時後，用0.2% SDS處理細胞後2小時，平均TEER值突然下降。（b）SDS培養(yang) 基加入前，TEER值最初是直線增加的，在用PBS加入頂端腔後，然後迅速穩定並保持，直到5分鍾的測量周期結束。當從(cong) 上部小室中移除培養(yang) 基後，由於(yu) 電路短路，TEER再次變成無數值。

在換到SDS培養(yang) 基2小時後，TEER曲線的變化就可以被檢測到。起初，TEER值與(yu) 加入SDS培養(yang) 基前相同。但是TEER值在測量期間穩步下降，直到穩定在一個(ge) 更低的值。這導致測得的平均TEER降低，這與(yu) 加入SDS引起的細胞裂解吻合。此外，隨著SDS培養(yang) 基加入時間的增加，電阻的初始峰幅值減小。盡管暴露於(yu) SDS，最初的峰值的持續似乎表明細胞存活。值得注意的是，以前的IMOLA-IVD研究是在簡單的單層細胞上進行的，相對較低濃度的0.2% SDS就可以較短的時間內(nei) 殺死細胞。而更加嚴(yan) 重細胞裂解過程相對緩慢可能歸因於(yu) 更複雜的3D皮膚模型中培養(yang) 的細胞的生命力的增強。

5. Conclusions

在這裏，我們(men) 提出了一種創新的方法，以非侵入性監測細胞培養(yang) 在二維和三維多孔膜在各種形態。我們(men) 的生物芯片密封設計被證明支持小鼠成纖維細胞的單層，以及更複雜的重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）。此外，設計了一個(ge) 兩(liang) 部分的自動化流體(ti) 係統，處理將PBS溶液輸送和加入到頂部腔室進行TEER測量。使用L929細胞，設計了一個(ge) 標準的操作方法，通過定期測量TEER來監測代謝率和屏障完整性。SDS培養(yang) 基加入之前保持的細胞活力，作為(wei) 陽性對照。

在用L929細胞進行初步試驗後，對重建人表皮細胞模型的TEER進行監測。TEER值顯示皮膚模型可以培養(yang) 至少24小時，加入SDS培養(yang) 基後的細胞裂解也會(hui) 延遲。在以後的實驗中可以使用更高的SDS濃度來提高對照的響應時間。總的來說，這項工作是一項概念驗證實驗，證明了IMOLA-IVD用於(yu) 複雜3D組織模型的能力，作為(wei) 非侵入式自動化細胞分析的工具。